CRISPR: ¡Tijeras genéticas ahora detectan ARN!

Las bacterias han desarrollado mecanismos de defensa especiales para protegerse contra los virus, que de ninguna manera infectan solo a los humanos. Como parte de estos llamados sistemas CRISPR-Cas, un ARN ribonucleico CRISPR (crRNA), que sirve como una “guía de ARN”, reconoce regiones de un genoma extraño, como el ADN viral. La nucleasa asociada a CRISPR (Cas), dirigida por un crRNA, lo vuelve inofensivo cortándolo como un par de tijeras. Los humanos han explotado esta estrategia: “CRISPR, a menudo llamado ‘tijeras genéticas’, es la base de muchas tecnologías moleculares”, dice Chase Beisel, jefe del departamento de Biología Sintética de ARN en el Instituto Helmholtz para la Investigación de Infecciones Basadas en ARN (HIRI) en Würzburg. El instituto es un sitio del Centro Helmholtz de Braunschweig para la Investigación de Infecciones (HZI) en cooperación con la Universidad Julius-Maximilians (JMU) de Würzburg, donde Beisel tiene una cátedra.

La plataforma de diagnóstico LEOPARD, desarrollada por el laboratorio de Beisel en cooperación con JMU en 2021, también aprovecha CRISPR como tecnología. LEOPARD tiene el potencial de detectar una variedad de biomarcadores relacionados con la enfermedad en una sola prueba. El enfoque se basa en la reprogramación de los factores de ARN, llamados tracrRNA. Esos ARN participan naturalmente en la producción de ARN guía utilizados por Cas9 y diferentes nucleasas Cas12. “LEOPARD se centró en Cas9. Sin embargo, los sistemas CRISPR-Cas también incluyen otro conjunto diverso de nucleasas, llamadas Cas12″, explica Beisel. Mientras que tanto Cas9 como Cas12 cortan objetivos de ADN, Cas12 puede aumentar la señal de salida realizando cortes en el ADN “colateral”. Esto puede hacer que las tecnologías de detección sean más sensibles y, por lo tanto, más eficientes.

El equipo dirigido por Chase Beisel ahora ha extendido las características únicas de LEOPARD a Cas12. Los investigadores han llamado al método resultante PUMA (Programmable tracrRNAs Unlock protospacer-adjacent Motif-independent detection of ribonucleic Acids by Cas12 nucleases). Los detalles de sus hallazgos son objeto de un artículo en la revista Nature Communications.

Superar obstáculos
Aunque las nucleasas Cas12 se utilizan ampliamente en el diagnóstico molecular, han persistido dos limitaciones principales: las tecnologías basadas en Cas12 se han limitado a los objetivos de ADN, y se requiere una secuencia de reconocimiento específica llamada PAM, abreviatura de protospacer-adjacent motif, para identificar la molécula diana.

PUMA aborda elegantemente estos desafíos. Al igual que LEOPARD, este nuevo método también se basa en tracrRNAs. “Usando PUMA, podemos reprogramar los tracrRNAs. Esto nos permite decidir qué biomarcador de ARN se convierte en un ARN guía. Este ARN guía, a su vez, dirige Cas12 a una molécula de ADN que proporcionamos y activa las tijeras genéticas”, explica el primer autor del estudio, Chunlei Jiao. Chunlei Jiao, un ex estudiante de posgrado e investigador postdoctoral en el laboratorio de Beisel, también estuvo involucrado en el desarrollo de LEOPARD. Recientemente comenzó una cátedra en la Universidad Nacional de Singapur. “El corte de ADN nos indica qué biomarcador estaba presente en la muestra, como los biomarcadores específicos de diferentes patógenos”, agrega Beisel.

Por lo tanto, el nuevo método permite la detección de biomarcadores de ARN utilizando nucleasas CRISPR que normalmente solo pueden reconocer ADN. “Esto es particularmente importante para los biomarcadores moleculares que solo se pueden encontrar a nivel de ARN. Esto incluye los virus de ARN, por ejemplo”, dice Beisel. Y sin embargo, PUMA no requiere una secuencia de reconocimiento específica: el PAM está contenido en la molécula diana de ADN proporcionada. Dado que los investigadores proporcionan la molécula diana, también pueden introducir ADN truncado. Como resultado, pudieron aumentar significativamente la velocidad del método.

Muchos pájaros, una piedra
“PUMA tiene el potencial de convertirse en una herramienta flexible y precisa para la detección de ARN”, concluye Beisel. Finalmente, el equipo demostró el potencial del método identificando cinco patógenos bacterianos asociados con la sepsis aguda. Su detección se basó en un solo tracrRNA universal y reprogramado, que proporciona una forma simplificada de diferenciar entre varios tipos de bacterias. Esto abre una amplia gama de posibles aplicaciones en medicina: “La nueva tecnología representa una nueva forma de diagnóstico CRISPR que permite pruebas moleculares confiables en el punto de atención, ya sea para la identificación de patógenos virales o bacterianos o la detección de biomarcadores de cáncer”, dice Jiao.

El equipo de investigación ya está planificando sus próximos pasos: “Nuestro objetivo es lograr una lectura multiplexada similar a la de LEOPARD y expandir el rango de aplicaciones de la tecnología”, dice Beisel, quien también anticipa un uso amplio en la comunidad de investigación: “Esperamos que nuestro estudio impulse la exploración adicional de la reprogramación de tracrRNA”.

Financiamiento
El estudio fue apoyado por fondos del Consejo Europeo de Investigación (ERC Consolidator Award a Chase Beisel) y el programa “GO-Bio initial” del Ministerio Federal de Educación e Investigación alemán (BMBF).

Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones:
Los científicos del Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones (HZI) en Braunschweig y sus otros sitios en Alemania están comprometidos con el estudio de las infecciones bacterianas y virales y los mecanismos de defensa del cuerpo. Tienen una profunda experiencia en la investigación de compuestos naturales y su explotación como una fuente valiosa de nuevos antiinfectivos. Como miembro de la Asociación Helmholtz y el Centro Alemán de Investigación de Infecciones (DZIF), el HZI realiza investigaciones traslacionales sentando las bases para el desarrollo de nuevos tratamientos y vacunas contra enfermedades infecciosas. www.helmholtz-hzi.de/en

Instituto Helmholtz para la Investigación de Infecciones Basadas en ARN:
El Instituto Helmholtz para la Investigación de Infecciones Basadas en ARN (HIRI) es la primera institución de este tipo en todo el mundo que combina la investigación de ácido ribonucleico (ARN) con la biología de las infecciones. Basándose en los nuevos descubrimientos de su sólido programa de investigación básica, el objetivo a largo plazo del instituto es desarrollar enfoques terapéuticos innovadores para diagnosticar y tratar mejor las infecciones humanas. HIRI es un sitio del Centro Helmholtz de Braunschweig para la Investigación de Infecciones (HZI) en cooperación con la Universidad Julius-Maximilians de Würzburg (JMU) y está ubicado en el Campus Médico de Würzburg. Más información en www.helmholtz-hiri.de.