Resumen:
Los aptameros de ADN de melanopsina que regulan las manecillas del reloj de los ritmos biológicos fueron desarrollados por el grupo de la Universidad de Tecnología de Toyohashi y el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (AIST).
Los aptameros de ADN pueden unirse específicamente a biomoléculas para modificar su función, lo que los convierte en posibles terapias de oligonucleótidos ideales. Cribamos el aptamero de ADN melanopsina (OPN4), un fotopigmento de luz azul en la retina que juega un papel clave en el uso de las señales luminosas para restablecer la fase de los ritmos circadianos en el reloj central.
Primero, se identificaron 15 aptameros de ADN de melanopsina (Melapts) después de ocho rondas de Cell-SELEX utilizando células que expresan melanopsina en la membrana celular. Posteriormente, se realizó un análisis funcional de cada Melapt en una línea celular de fibroblastos que expresa de manera estable tanto Period2:ELuc como melanopsina al determinar el grado en que reajustan la fase de los ritmos circadianos de los mamíferos en respuesta a la estimulación con luz azul. La expresión rítmica de Period2 durante un período de 24 horas se monitorizó en fibroblastos estables Period2:ELuc: timidina quinasa (TK):OPN4 que expresan melanopsina. En el amanecer subjetivo, se observó que cuatro Melapts avanzaban su fase en más de 1,5 horas, mientras que siete Melapts la retrasaban en más de 2 horas. Unos pocos Melapts causaron un desplazamiento de fase de aproximadamente 2 horas, incluso en ausencia de fotostimulación, presumiblemente porque los Melapts sólo pueden afectar parcialmente la señalización de entrada para el desplazamiento de fase. Además, se utilizaron algunos desplazamientos de fase inducidos por Melaps en ratones transgénicos Period1::luc (Tg) para monitorizar los ritmos circadianos mediante la expresión rítmica de Period1.
Estos aptameros de ADN pueden tener la capacidad de afectar a la melanopsina in vivo. En resumen, los aptameros Melapts pueden regular con éxito la señal de entrada y el cambio de fase (tanto avance de fase como retraso de fase) de los ritmos circadianos de los mamíferos in vitro e in vivo.
Detalles:
Mejorar indirectamente el ciclo de sueño-vigilia manipulando la capacidad de la melanopsina para enviar señales al reloj central sería social y económicamente ventajoso.
La melanopsina es una proteína fotorreceptora expresada en las células ganglionares de la retina que absorbe la luz azul con una absorción máxima de 477 nm. Se sabe que la melanopsina juega un papel importante en el restablecimiento de la fase del reloj circadiano de los mamíferos mediante la luz azul y la expresión rítmica de los genes del reloj, como Period1,2 (Per1,2). La fase del reloj circadiano molecular se restablece por y depende del tiempo de estimulación lumínica y de la inducción transitoria de Per1 por el fotorreceptor de la melanopsina (Fig. 1). Recientemente, los antagonistas de la melanopsina adquiridos mediante la criba química de bibliotecas químicas contribuyen principalmente a retrasar la fase del ritmo.
En este estudio, utilizamos el método de evolución celular sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (Cell-SELEX) para identificar aptameros de ADN (ADN monocatenario; ssADN) que provocan que la melanopsina cambie la fase de los ritmos circadianos. En total, se analizaron 15 tipos de aptameros de melanopsina (Melapts 1-15) para evaluar su capacidad de cambiar la fase de las oscilaciones bioluminiscentes de Per2::ELuc en células estables Per2:ELuc:TK:Mel, en las que un reportero bioluminiscente sigue la región del promotor Per2 que controla una luciferasa emisora de verde mejorada de Pyrearinus termitilluminans, con melanopsina sobreexpresada bajo el control del promotor de la timidina quinasa (TK). En estas líneas celulares de fibroblastos estables, la vía de señalización está incorporada en una célula de fibroblastos que imita la vía de señalización desde la retina al reloj principal central (núcleo o núcleos supraquiasmático: SCN) por la melanopsina (Fig. 2).
Los aptameros de ADN son moléculas cortas de ARN/ADN monocatenario que pueden unirse selectivamente a dianas específicas, proteínas, péptidos y otras moléculas y pueden utilizarse clínicamente para cambiar la función de las moléculas diana. Las principales ventajas de estos aptameros incluyen su alta especificidad hacia el objetivo, la ausencia de inmunogenicidad y la facilidad de síntesis.
Entre los 15 aptameros de ADN de melanopsina (Melapts), cuatro Melapts indujeron un avance de fase y siete Melapts indujeron un retraso en los ritmos circadianos (en más de 1,5 horas y más de 2 horas, respectivamente) en la línea celular Per2::ELuc. Unos pocos Melapts indujeron desplazamientos de fase de aproximadamente 2 horas, incluso en ausencia de fotostimulación in vitro.
Melapt04 y Melapt10 indujeron un avance o retraso de fase del reloj circadiano de aproximadamente 3 horas, respectivamente, tanto en CT22 como en CT8 durante el proceso de entrada de la señal lumínica. Esto sugiere que Melapt04 regula la fase de los ritmos circadianos y facilita el sueño y el despertar, principalmente a través del avance de fase (Fig. 3-5). Existen dos Melaptes que avanzan y retrasan el desplazamiento de fase en la misma dirección, independientemente del momento del fotostimulo. Sin embargo, los tres Melaptes avanzaron y retrasaron el desplazamiento de fase en direcciones opuestas al amanecer y al anochecer. Por lo tanto, se espera que estos Melapts sean útiles para regular las fases de los ritmos (Fig. 6,7).
Realizamos experimentos in vivo similares a los experimentos in vitro para investigar si la unión de Melapt a la melanopsina en la retina que proyecta al SCN afectaba los desplazamientos de fase del reloj central en el SCN. Ratones transgénicos Per1 :: luc: ratones en los que el gen recombinante Per1::luc se insertó en el genoma de todas las células. Per1::luc es un gen recombinante en el que la región del promotor Per1 va seguida de una enzima luciferasa derivada de las luciérnagas como reportero para monitorizar los ritmos circadianos.
Se inyectaron ocho tipos de Melapt que causan respuestas de desplazamiento de fase en los ritmos de expresión de Per2 en los experimentos in vitro en los bulbos de los ojos de ratones Tg Per1::luc en CT22 (Fig. 8, 9). Melapt01, Melapt03, Melapt04, Melapt07, Melapt09 y Melapt10 mostraron capacidades de desplazamiento de fase similares a las de las células estables Per2:ELuc:TK:Mel: in vivo e in vitro.
El efecto de Melapt en el desplazamiento de fase en los experimentos in vivo puede predecirse a partir de los experimentos in vitro. Además, los desplazamientos de fase totales se limitaron a 3 horas en animales intactos, independientemente de la magnitud del avance o el retraso por parte de los Melapts en las células Per2:Eluk:TK:Mel.
En conclusión:
En resumen, los Melapts fueron capaces de regular las señales de entrada y los desplazamientos de fase para lograr tanto el avance de fase como el retraso de fase en los ritmos circadianos de los mamíferos in vitro e in vivo.
Los Melapts podrían contribuir a futuras investigaciones centradas en el restablecimiento de las fases del reloj circadiano. Los Melapts podrían ayudarnos a adaptarnos mejor a los ciclos de vida social modernos, permitir que los cultivos y los animales domésticos se mejoren para una mayor productividad y ayudar a los trabajadores por turnos a superar el desfase horario social ajustando las fases del reloj circadiano. Estos Melapts podrían contribuir a restablecer la fase de los relojes circadianos en las vías de entrada fóticas.
Agencia de financiación:
Este estudio fue apoyado por financiación de investigación de TechnoPro Inc., TechnoPro R&D Company y el Programa para Fomentar a Jóvenes Investigadores en Investigación Interdisciplinaria de Vanguardia (RN). La financiación para Científicos Kiban (a RN 24590350 y 20H00614) se obtuvo de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), la Fundación de Ciencias Mitsubishi (a RN) y una Subvención de Investigación para la Innovación Científica y Tecnológica en la Universidad de Tecnología de Toyohashi (a RN). Este estudio también fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (YN 21H02083).
Referencia:
“Los aptameros de ADN de melanopsina pueden regular las señales de entrada de los ritmos circadianos de los mamíferos alterando la fase del reloj molecular”
Kazuo Nakazawa1,2, Minako Matsuo3,Yo Kikuchi,i1,3,Yoshihiro Nakajima4,Rika Numano1,3
1Departamento de Química Aplicada y Ciencias de la Vida, Universidad de Tecnología de Toyohashi, Toyohashi, Aichi, Japón
2TechnoPro, Inc., Tokio, Japón
3Instituto de Investigación sobre Semiconductores y Ciencia de la Sensibilidad de Próxima Generación, Universidad de Tecnología de Toyohashi, Toyohashi, Aichi, Japón
4Investigación de Salud y Médica, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (AIST), Takamatsu, Kagawa, Japón
Frontiers in Neuroscience, Sec. Sueño y Ritmos Circadianos, Volumen 18, 2024
Revista
Fronteras en Neurociencia
Método de Investigación
Estudio experimental
Asunto de Investigación
No aplica
Título del artículo
Los aptameros de ADN de melanopsina pueden regular las señales de entrada de los ritmos circadianos de los mamíferos alterando la fase del reloj molecular
Fecha de publicación del artículo
17-Abr-2024
